小鼠單個(gè)核細(xì)胞分離一步梯度法去除死細(xì)胞
2010-06-24
[2271]
基本原理
活細(xì)胞（密度較?。┖退兰?xì)胞（密度較大）密度不同，從而有助于將活的淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞分離。
附加材料
高密度溶液：Ficoll-Paque（Ficoll和泛影酸鈉；Pharmacia LKB）或Lympholyte-M（Cedarlane）
12ml或50ml聚丙烯離心管（比聚苯乙烯離心管好）
注：Ficoll-Paque和Lympholyte-M的密度與溫度有關(guān)；該方法中所采用的以及其他商品化的高密度溶液適合在室溫中使用。因此應(yīng)注意使細(xì)胞懸液、離心和高密度溶液控制在室溫。否則會(huì)因活細(xì)胞沉入離心管底導(dǎo)致在密度界面上損失活細(xì)胞。
實(shí)驗(yàn)方案
1、用RPMI-5*培養(yǎng)基混懸細(xì)胞，分裝到離心管中使其細(xì)胞數(shù)達(dá)到0.5×108～1×108個(gè)細(xì)胞/2ml（12ml離心管）或1×108～5×108個(gè)細(xì)胞/5ml（50ml離心管）。
2、用移液器吸取3ml（使用12ml離心管時(shí)）或5ml（使用50ml離心管時(shí)）高密度溶液，將槍頭伸到離心管底，緩慢將高密度溶液加入細(xì)胞懸液下方。
3、室溫，800g離心15min。為了取得好的分離效果，將離心機(jī)的“brake”開(kāi)關(guān)關(guān)掉。
4、使用5ml移液器，沿高密度層表面緩慢移動(dòng)移液器槍頭，吸入漂浮在高密度層上方的活細(xì)胞，盡量少收集高密度溶液。將活細(xì)胞移入另一管中。
5、加入RPMI-5*培養(yǎng)基（少量細(xì)胞加入10ml，細(xì)胞量較多時(shí)加入40ml），室溫，200g離心10min。重復(fù)一次。
6、以適量培養(yǎng)基混懸細(xì)胞以便進(jìn)行下一步操作。
